规律性短重复回文序列簇（CRISPR）和 CRISPR 辅助蛋白 9（Cas9）构成的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术快速推进了基因修饰猪作为医学研究模式动物的广泛应用。而高效的靶基因单链向导 RNA（sgRNA）是利用 CRISPR/Cas9 技术进行基因编辑成功的关键，对于猪等繁殖周期较长的大动物，则需要在实施动物实验前，在体外筛选出高效的 sgRNA 以避免时间和资源成本浪费。另外，如何高效获得阳性基因编辑单克隆细胞是目前尚待解决的难题。本研究建立了靶向猪基因组的 sgRNA 快速筛选方法，利用荧光载体富集基因编辑细胞，同时探索利用图案微阵列培养技术快速获得单克隆细胞的方法，在此基础上高效获得延胡索酰乙酰乙酸酶（Fah）基因编辑细胞，为后续生产作为人类肝细胞生物反应器的Fah基因敲除猪奠定基础。
引用本文： 高孟雨, 朱星龙, 王诗盛, 张炳琪, 张芸琳, 何宇婷, 周燕燕, 李顺, 杨光, 廖光能, 包骥, 步宏. 靶向猪基因组单链向导RNA快速筛选以及利用图案微阵列收获单克隆细胞的研究. 生物医学工程学杂志, 2021, 38(1): 111-121. doi: 10.7507/1001-5515.202006032 复制
引言
目前，规律性短重复回文序列簇（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）和 CRISPR 辅助蛋白 9（CRISPR-associated 9，Cas9）构成的 CRISPR/Cas9 已经广泛用于鼠[1-2]、兔[3]、猪[4]、猴[5-6]等多种动物的研究，研究领域包括基因功能研究、基因治疗、疾病模型生产等。利用 CRISPR/Cas9 技术结合体细胞核移植（somatic cell nuclear transplantation，SCNT）获得基因编辑猪、猴等大动物模型，是目前最常用的方法，而获得经过基因编辑的单克隆细胞作为核移植供体是生产基因改造动物的前提[7-8]。另外，CRISPR/Cas9 技术高效发挥作用的关键是靶基因的单链向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）筛选，由于猪繁育周期平均为 114 d，因此在实施动物实验前，在体外通过细胞实验筛选出高效的 sgRNA，对于快速获得基因修饰猪是十分必要的，而且还能避免时间、资源等的浪费[9]。CRISPR/Cas9 系统发挥作用需要通用的 Cas9 核酸酶蛋白[10-11]，但由于 Cas9 核酸酶蛋白基因片段较大，通常一个载体无法将 Cas9、sgRNA 以及抗性基因或荧光蛋白标签等多个元件同时包含，导致无法对基因编辑细胞进行筛选，以至于加大了获得基因编辑细胞的难度。另外，即使一个质粒能够完整包装筛选标签，但是过大的质粒，也使细胞转染难度随之增大，导致转染效率降低。
目前获得基因编辑单克隆细胞的常用方法主要是极限稀释法以及机械挑取法，然而这两种方法获得的单克隆往往混有其他细胞，无法真正获得由一个细胞分化而来的细胞群[12-13]。并且由于机械力度的损伤，收获的细胞通常状态较差，并且操作时间长，单克隆收获率低，对于需要大批量获得单克隆细胞的实验而言，将大大影响实验进程[14]。若通过传统方法获得单基因乃至多基因编辑的单克隆细胞，则操作难度将更大。另外，即使通过极限稀释法或者流式细胞术将一个细胞分置到一个孔中进行培养，由于缺乏细胞生长的微环境，在单个细胞的环境中，有的细胞往往也无法正常分裂增殖。
基于以上原因，本研究的目的是构建一套靶向猪基因组 sgRNA 快速筛选平台，并利用荧光报告载体，建立一种可以富集基因突变细胞的策略，同时利用图案微阵列技术探索一种快速、对细胞损伤较小的单克隆细胞获得方式，并以延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，Fah）基因（简称：Fah基因）敲除为例，以期实现高效快速地获得Fah基因敲除细胞。本研究流程图如图 1 所示。
图1
高效获得猪基因编辑单克隆细胞实验流程图
Figure1.
Flow chart of experiments for efficient acquisition of pig gene-edited monoclonal cells
1 材料和方法
1.1 实验材料与试剂
实验中所使用的细胞株包括：家猪皮肤细胞（domestic pig skin cells，SSC-S1），小香猪皮肤细胞（small pig skin cells，SSC-S2），小耳猪肾细胞（small ear pig kidney cells，SEPfk），小耳猪肺细胞（small ear pig-lung cells 1，SEP-L1）以及猪肾上皮细胞（porcine kidney epithelial cells，PK15）来于中国科学院昆明动物所；猪髋动脉内皮细胞（porcine hip arteries endothelial cells，PIEC）来自于中科院上海细胞库；小型猪肾细胞（mini pig kidney epithelial cells，MPK），来自于中国食品药品检定研究院；猪睾丸细胞（porcine testicular cell，ST），猪肾传代细胞（porcine kidney cells-2，IBRS-2）来自于中国典型培养物保藏中心细胞库，总计 9 种细胞。sgRNA 骨架表达载体 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen，购自中国汉恒生物公司；Cas9 慢病毒购自中国汉恒生物公司。兔抗 Cas9 抗体购自美国 Abcam 公司；T4 多聚核苷酸激酶、快速连接试剂盒均购自美国 NEW ENGLAND BioLabs 公司；无内毒素小提中量试剂盒购自中国天根生化科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、DMEM 高糖培养基、RPMI 1640 培养基、MEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Gibco 公司；兔抗人、鼠 Fah 抗体购自中国 BIOSS 公司；用于细胞测序的 T 克隆载体 pClone007 试剂盒购自中国擎科生物公司。
1.2 构建猪 Cas9 稳定表达细胞株
用 MEM 培养基+10%FBS 培养 IBRS-2、ST 细胞；用 DMEM 高糖培养基+10 % FBS 培养 PK15、MPK、SSC-S2、SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞；用 RPMI 1640 培养基+10 % FBS 培养 PIEC 细胞。随后将生长状态良好的细胞制成细胞悬液，并以 1 × 105 个/孔的细胞密度接种到 24 孔板中。待目的细胞达到约 30%～50%融合密度时加入 Cas9 慢病毒。Cas9 慢病毒滴度为：108 TU/mL；PIEC、ST、IBRS-2、PK15 细胞的最适感染复数（multiplicity of infection，MOI）为：30；SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞的最适 MOI 值为：20。病毒感染细胞 72 h 后，在培养液中加入嘌呤霉素，进行抗性筛选并获得 Cas9 稳定表达细胞株。PIEC 细胞筛选浓度为 1 μg/mL，IBRS-2 细胞筛选浓度为 2.5 μg/mL；PK15 细胞筛选浓度为 2 μg/mL；ST 细胞筛选浓度为 2.5 μg/mL；SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞筛选浓度为 0.5 μg/mL。
1.3 Cas9 稳定表达细胞株免疫组织化学染色
将 2 × 105个细胞接种于底部放有玻片的 24 孔板中，进行细胞接种实验。细胞培养过夜后，用 PBS 清洗三遍，10% 福尔马林固定细胞 5 min，PBS 再次清洗三遍，取出细胞玻片，黏于载玻片干燥过夜，随后使用兔抗 Cas9 抗体对细胞玻片进行常规免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色。
1.4 Cas9 稳转猪细胞转录组测序以及蛋白质组定量分析
抽提 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 细胞以及相对应的 Cas9 稳转细胞的 RNA 样品，送到华大基因公司进行细胞表达谱信息采集。提取 PIEC- Cas9，PK15- Cas9，IBRS-2-Cas9，ST- Cas9 四种稳转细胞的蛋白送到上海易算生物公司进行蛋白质组学定量分析。将测序结果整理后，搭建常见猪基因组/蛋白表达情况查询网页，便于查询以及比较不同猪细胞的基因以及蛋白表达量。
1.5 构建 Fah基因的 sgRNA 表达载体
合成 3 条靶向Fah基因的 sgRNA，即Fah-sgRNA1、Fah-sgRNA2、Fah-sgRNA3，其正向和反向寡核苷酸序列分别如表 1 所示。将Fah-sgRNA 对应的正向和反向寡核苷酸序列进行磷酸化、退火、复性，形成具有粘性末端的双链 DNA 片段。利用 BamHI、EcoRI 限制性内切酶酶切目标载体 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen，随后电泳分离并胶回收 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen 线性载体。将复性得到的Fah-sgRNA 双链 DNA 片段与回收得到的线性载体片段进行连接反应，然后将连接混合物转化到大肠杆菌 DH5α 菌株。将连接正确的质粒扩增后，采用无内毒素小提中量试剂盒抽提质粒，用于细胞转染实验。
表1
Fah基因 sgRNA 序列
Table1.
The sgRNA sequence of Fah gene
1.6 Fah基因的 sgRNA 表达载体转染实验
本实验采用电转仪将质粒转入 PIEC-Cas9 靶细胞，方法如下：将生长状态良好的细胞经胰蛋白酶消化，并用电转液稀释成浓度为 1 × 106～2 × 106 个/mL 的细胞悬液。将上述提取的 1 μg sgRNA 表达质粒，与约 2 × 105 个细胞混合置于 96 孔板中，按照电压 200 V、脉宽 200 μs、间隔 1 000 ms 的条件进行电转实验，然后将电转后的细胞平均三等分转入 24 孔板中培养。
1.7 流式分析细胞感染效率以及分选阳性转染细胞
细胞转染 48 h 后先进行扩增培养，然后将贴壁细胞经胰酶消化，离心后用新鲜培养基重悬，将细胞悬液移至无菌的流式检测管，检测质粒转染效率并分选荧光表达阳性的细胞到 24 孔板中，进一步扩增阳性细胞。
1.8 错配酶切法检测Fah基因敲除效果
收集部分目的细胞，抽提基因组 DNA，同时抽提野生型目的细胞的基因组 DNA。以基因组 DNA 为模板分别用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增靶基因Fah序列片段。扩增靶基因片段的引物如表 2 所示。电泳检测 PCR 产物并回收纯化，将纯化后的 DNA 片段分别加热变性、复性，形成杂交 DNA 分子。用 T7 核酸内切酶 I（T7 endonuclease I，T7EI）切割复性后的杂交 DNA，检测 sgRNA 介导的 Fah基因敲除效果。
表2
Fah基因靶点扩增引物序列
Table2.
Primer sequences for Fah target gene amplification
1.9 利用图案微阵列法快速获得Fah基因敲除单克隆细胞以及鉴定
使用激光蚀刻的特定图案硅片为模板，倒模获得聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）印章，制备出具有特定微图案的 PDMS 印章（面积为 225 μm2的矩形）。将浓度为 100 μg/mL 的纤连蛋白涂布于印章表面，室温孵育 20 min 后洗去多余的溶液。在 37 ºC 孵箱中干燥，然后将图案印压于细胞非黏附培养皿底部，待图案形成后移去印章。图案干燥后，加入 1% 嵌段式聚醚 F-127 室温孵育 2 h，封闭剩余培养皿底部上的空间。具体制备方法如图 2 所示。随后将经过流式分选的 1 × 103 个细胞种植到微阵列培养皿中连续监测细胞生长，并挑取单克隆细胞球。
图2
图案微阵列印章法获得单克隆细胞流程
Figure2.
The process of obtaining monoclonal by microarray seal
1.10 T 载体测序鉴定单克隆细胞Fah基因敲除情况
收集待检测的单克隆细胞，抽提基因组。PCR 扩增单克隆细胞的Fah基因片段，使用胶回收试剂盒切胶回收Fah目的片段，利用 pClone007 试剂盒将Fah PCR 产物连接到 T 载体。为了分析每个单细胞克隆的正义链以及反义链的突变情况，对每个单克隆细胞进行 6 个 T 载体的克隆测序，以确保单克隆的纯度。
1.11 Fah基因敲除细胞免疫荧光染色以及 IHC 染色
在 24 孔板底部放入玻片，将 2 × 105个细胞接种于 24 孔板，细胞培养过夜。使用 10% 福尔马林固定细胞 5 min，用 PBS 清洗三遍，随后取出细胞玻片，黏于载玻片上干燥过夜。使用兔抗人、鼠 Fah 抗体进行常规 IHC 以及免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色。
2 结果
2.1 利用慢病毒载体构建猪 Cas9 稳定表达细胞株
在本研究中，SSC-S2、SEPfk、SSC-S1、SEP-L1、MPK 这五种细胞，本身增殖就相对较缓慢，在经过慢病毒转染以及加入嘌呤霉素筛选两个连续过程后，细胞增殖则更加缓慢，细胞状态较差，死亡较多，无法构建成 Cas9 稳定表达细胞株，不适合作为工具细胞长时间使用。经过慢病毒转染以及嘌呤霉素抗性筛选两个过程，PIEC、PK15、ST、IBRS-2 这四种猪细胞仍保持良好的细胞形态以及增殖能力。与转染了 Cas9 慢病毒的细胞相比较，未转染 Cas9 慢病毒的对照组细胞在加入嘌呤霉素 72 h 以后几乎全部死亡，意味着筛选效率达 100%。在经过连续 7 d 的嘌呤霉素筛选后，四种 Cas9 稳转细胞生长状态良好，与正常细胞相比无明显差异，如图 3 所示。因此，最终经过对常见猪细胞株的筛选实验，获得了 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、ST-Cas9、IBRS-2-Cas9 四种猪 Cas9 稳转细胞。为进一步证实稳转细胞的 Cas9 表达情况，利用 IHC 对稳转细胞进行验证，直观可见四种细胞均高效表达 Cas9 核酸酶蛋白，如图 3 所示。
图3
猪 Cas9 稳定表达细胞株的构建
Figure3.
Construction of stable Cas9-expressing cell lines of pigs
2.2 转录组测序分析猪 Cas9 稳定表达细胞株
本研究对 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 四株细胞系以及对应的 Cas9 稳转细胞即 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 进行转录组测序，并且进行比较分析。为了反映样本间基因表达的相关性，本研究计算了每两个样品之间所有基因表达量的皮尔森（Pearson）相关系数，并将这些系数以热图的形式反映出来，如图 4 所示。从样品间相关性分析结果可以看出 PIEC 与 PIEC-Cas9、PK15 与 PK15-Cas9、IBRS-2 与 IBRS-2-Cas9、ST 与 ST-Cas9，呈现相关性最高，Pearson 相关系数均在 0.9 以上，而 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 四种细胞之间基因表达相关性则相对较低。
图4
细胞基因以及蛋白表达分析
Figure4.
Analysis of cell gene and protein expression
转录组基因表达量以每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数（fragments per kilobase per millions base pairs sequenced，FPKM）值来衡量。对 FPKM（FPKM ≤ 1、FPKM 1～10、FPKM ≥ 10）的三种情况进行基因数目的统计，结果表明不同细胞存在不同基因的表达量区别，说明利用细胞筛选靶向猪基因组的 sgRNA 要根据基因表达情况，选定不同的猪细胞进行实验，更有益于筛选并验证出靶基因的 sgRNA 打靶效果。同时，由于慢病毒是随机整合到细胞基因组，因此会无法避免地造成原有细胞基因组的微小改变，而引入 Cas9 核酸酶蛋白基因后，细胞基因表达量虽有所改变，但与对应的野生型细胞（wide type，WT）相比较仍然显示出很强的相关性。
2.3 猪 Cas9 稳定表达细胞株蛋白质组定量分析
对猪 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 稳转细胞进行蛋白质组定量分析，本研究获得了每种稳转细胞的蛋白组表达情况。如图 4 所示，由截选的部分蛋白表达热图可见四种 Cas9 稳转细胞的蛋白表达差异。为方便流程化检索，搭建了常见猪细胞系基因以及蛋白表达检索平台 PiGenEditer（网址为：https://www.omicsolution.org/wukong/PiGenEditer/）。通过输入基因或蛋白号即可查询并比较不同细胞的基因或者蛋白表达量。利用该平台快速查出目的细胞基因或蛋白表达水平，综合二者表达情况，以快速确定靶基因表达较高的 Cas9 稳转猪细胞，进行 sgRNA 体外筛选实验。经综合评估 mRNA 以及蛋白表达情况，本实验用于构建Fah基因敲除的细胞选定为 PIEC-Cas9。
2.4 靶向Fah基因 sgRNA 设计以及筛选
对Fah基因前 5 个外显子编码区序列进行 sgRNA 设计，根据 sgRNA 设计软件所示综合评分，选择 3 条Fah-sgRNA，即Fah-sgRNA-2、Fah-sgRNA-3、Fah-sgRNA-4，分别打靶 2 号（#2）、3 号（#3）、4 号（#4）外显子。将选择的 sgRNA 序列连接到表达载体后，利用电转仪将Fah-sgRNA 表达质粒快速转入 PIEC-Cas9 细胞，转染 24 h 后使用显微镜观察细胞，细胞生长状况良好，无明显死亡。在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）高效表达，指示了 sgRNA 在细胞内的高效表达，如图 5 所示。
图5
sgRNA 筛选以及富集基因编辑细胞
Figure5.
sgRNA screening and enrichment of gene-edited cells
为筛选出有效的 sgRNA，在电转 72 h 后收集细胞，提取细胞基因组 DNA，利用 PCR 扩增靶序列，随后进行 T7EI 错配酶切实验。如图 5 所示，靶向Fah基因 2 号、4 号外显子的 sgRNA 为 T7EI 错配酶切阳性结果，表明 sgRNA 对靶序列基因片段进行了有效切割，并引入了突变。结合 T7EI 错配酶切结果以及 sgRNA 选择原则，即选用比较靠前的外显子为靶序列，因此本实验选择靶向Fah基因 2 号外显子的 sgRNA 即Fah-sgRNA-2，用于构建Fah基因敲除细胞。随后将电转了Fah-sgRNA-2 质粒的细胞利用流式进行检测，结果显示表达 GFP 的阳性细胞占 47.4%，同时本文通过无菌分选富集这部分阳性细胞，用于后续单克隆挑选。
2.5 利用微阵列培养技术快速获得基因敲除单克隆细胞
为了克服单克隆细胞获得率低、状态差、生长周期长的问题，本研究通过图案微阵列培养技术，可以快速收获由单个细胞增殖而来的细胞球。如图 6 所示为荧光蛋白标记的微阵列印章形状，细胞将在每个荧光小方格所示的位置上生长。
图6
微阵列孔板培养细胞获得Fah基因敲除细胞
Figure6.
Fah gene knockout cells were obtained from microarray plate
如图 6 所示，将细胞按一定密度种植于微阵列孔板中，通过对细胞进行连续 4 d 的监测，在固定位置上清晰可见单个细胞以及分裂增殖了的细胞贴壁生长。在 24～48 h 内，细胞开始由贴壁状态转为呈三维球状生长，逐渐形成约 50 μm 的细胞球。在 96 h 以后细胞球几乎不再继续增长，保持在约 100 μm，同时可见个别细胞球开始松动，欲脱离原有位置。第 5 d 开始细胞球经过摇晃或使用移液枪轻轻吹打，可以自动成球脱落。将脱落的细胞球进行稀释，肉眼即可看见悬浮的细胞球。将单个细胞球吸出吹散后，进行扩增培养，48 h 即可快速获得生长状态良好的细胞。本实验随机吸取两个细胞球，进行 T 载体测序分析，分别获得了一个纯和突变以及一个杂合突变的基因编辑细胞。对纯和突变的细胞进行 IHC 以及 IF 验证，通过与 WT 细胞相比较，经过基因敲除的细胞（knockout，KO）不表达 Fah 蛋白，表明成功获得Fah基因突变细胞。
3 讨论
CRISPR/Cas9 系统发挥作用主要依赖于高效的特异性 sgRNA 以及通用的 Cas9 核酸酶蛋白[15]。目前，CRISPR/Cas9 系统导入细胞最常见的方式主要包括两种。一种是病毒介导的，即通过慢病毒、腺病毒或者腺相关病毒载体携带 CRISPR/Cas9 系统转染到细胞中。另外一种是非病毒方式介导的，如通过脂质体等转染试剂将 CRISPR/Cas9 系统表达质粒转入到细胞中[16-18]。但以上方式都因为 Cas9 核酸酶蛋白基因片段较大，很难将 Cas9 核酸酶蛋白以及荧光蛋白或者其他抗性筛选基因同时包装到一个载体中，以至于无法评估转染效率[19-21]。另外还有一种方式是将 Cas9 核酸酶蛋白以及 sgRNA 在体外转录后形成复合物，再通过转染试剂或电转仪将其转染到细胞。然而由于蛋白分子较大，因此转染效率也非常的低[22-23]。针对一些悬浮细胞，转染难度则更大，转染效率更低。CRISPR/Cas9 系统转染效率直接影响了获得基因编辑细胞的效率，而以上提到的转染大片段质粒或者蛋白都会大大降低转染效率。基于以上原因，先构建 Cas9 稳转细胞，再转入 sgRNA 则可以大大提高 CRISPR/Cas9 系统转染效率，进而提高获得基因编辑细胞的效率。本实验利用慢病毒成功构建了四种猪 Cas9 稳转细胞，这些稳转细胞可以作为筛选靶向猪基因组的 sgRNA 工具细胞，在后续实验中仅需在细胞里引入带 GFP 的 sgRNA 质粒即可实现基因编辑，并观察转染效率。
利用 CRISPR/Cas9 技术进行高效率的基因编辑，其中一个关键在于 sgRNA 的筛选[24]。尤其对于繁育周期较长的大动物，为节约时间和资金成本，必须在体外验证出高效的 sgRNA，因此需要选定一株合适的细胞进行 sgRNA 效率筛选实验。然而由于不同的细胞在 mRNA 水平以及蛋白水平表达存在差异，因此本实验对构建的 PK15-Cas9、PIEC-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 稳转细胞进行 mRNA 以及蛋白水平的测定，并且搭建了常见猪细胞 mRNA/蛋白水平表达查询网页，可以快速选择一株适合的细胞，在基因以及蛋白水平对 sgRNA 敲除效果进行筛选以及验证。
另外，富集成功转染 CRISPR/Cas9 系统的目的细胞，以期获得基因编辑的活细胞也十分重要[25-28]。因此本文研究探索了一种利用 Cas9 稳转猪细胞结合荧光报告的质粒载体来富集含有基因突变细胞的有效方法，即以 Cas9 稳定表达细胞作为工具细胞，将带有 GFP 筛选标签的靶基因 sgRNA 导入细胞，快速实现了基因编辑。另外为了高效地将 sgRNA 转入细胞，同时避免较高成本的病毒包装，采用电转染的方式将包含 GFP 的 sgRNA 表达质粒转入 Cas9 稳转细胞，建立了高效的 Cas9 稳转细胞电转染方案，以此增加转染效率，进一步增强基因编辑效率，筛选出高效的 sgRNA。
人类肝细胞的短缺是肝细胞移植治疗代谢性肝病的一个重要障碍[29-30]，因此本研究期望Fah缺陷猪可以成为人肝细胞的体内孵育器，从而为治疗人类代谢性肝病以及肝细胞移植提供个体化的方法，因而选定Fah为靶基因。本研究利用 PIEC-Cas9 细胞，经过电转的方式将带有 GFP 指示的 sgRNA 高效转入细胞，筛选得到有效靶向Fah基因的 sgRNA，随后利用流式细胞术对 GFP 强表达的细胞进行无菌分选，以此富集阳性细胞。
另外，为了提升单克隆细胞的获得效率，本研究使用图案微阵列技术，在细胞培养皿底部限制细胞生长以及黏附空间，使得细胞在培养 24 h 后形成三维细胞树样结构，进而在培养 96 h 后形成直径在 100 μm 左右的三维细胞微球。由于该微球与培养底面接触面狭小，黏附不牢固，所以当细胞球长成一定大小以后，摇动或者用移液枪轻轻吹打，其会自动从底面脱落。脱落的细胞球肉眼可见，将这些脱落的细胞球稀释，吸取单个细胞球分别于孔板中吹散后培养，仅需一周即可快速获得生长状态良好的单克隆细胞。基于以上策略，本研究快速获得了两个Fah基因敲除单克隆，大大缩短了单克隆细胞的获得时间。
综上所述，本文方法能够高效富集靶向猪基因组修饰的细胞，并且创新性地利用图案微阵列技术获得单克隆，大大加速单克隆的获取效率，为大批量挑取单克隆提供了有效方法，同时，获得的Fah基因突变细胞也为生产基因编辑猪以及基础医学研究等后续工作奠定了基础。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
目前，规律性短重复回文序列簇（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）和 CRISPR 辅助蛋白 9（CRISPR-associated 9，Cas9）构成的 CRISPR/Cas9 已经广泛用于鼠[1-2]、兔[3]、猪[4]、猴[5-6]等多种动物的研究，研究领域包括基因功能研究、基因治疗、疾病模型生产等。利用 CRISPR/Cas9 技术结合体细胞核移植（somatic cell nuclear transplantation，SCNT）获得基因编辑猪、猴等大动物模型，是目前最常用的方法，而获得经过基因编辑的单克隆细胞作为核移植供体是生产基因改造动物的前提[7-8]。另外，CRISPR/Cas9 技术高效发挥作用的关键是靶基因的单链向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）筛选，由于猪繁育周期平均为 114 d，因此在实施动物实验前，在体外通过细胞实验筛选出高效的 sgRNA，对于快速获得基因修饰猪是十分必要的，而且还能避免时间、资源等的浪费[9]。CRISPR/Cas9 系统发挥作用需要通用的 Cas9 核酸酶蛋白[10-11]，但由于 Cas9 核酸酶蛋白基因片段较大，通常一个载体无法将 Cas9、sgRNA 以及抗性基因或荧光蛋白标签等多个元件同时包含，导致无法对基因编辑细胞进行筛选，以至于加大了获得基因编辑细胞的难度。另外，即使一个质粒能够完整包装筛选标签，但是过大的质粒，也使细胞转染难度随之增大，导致转染效率降低。
目前获得基因编辑单克隆细胞的常用方法主要是极限稀释法以及机械挑取法，然而这两种方法获得的单克隆往往混有其他细胞，无法真正获得由一个细胞分化而来的细胞群[12-13]。并且由于机械力度的损伤，收获的细胞通常状态较差，并且操作时间长，单克隆收获率低，对于需要大批量获得单克隆细胞的实验而言，将大大影响实验进程[14]。若通过传统方法获得单基因乃至多基因编辑的单克隆细胞，则操作难度将更大。另外，即使通过极限稀释法或者流式细胞术将一个细胞分置到一个孔中进行培养，由于缺乏细胞生长的微环境，在单个细胞的环境中，有的细胞往往也无法正常分裂增殖。
基于以上原因，本研究的目的是构建一套靶向猪基因组 sgRNA 快速筛选平台，并利用荧光报告载体，建立一种可以富集基因突变细胞的策略，同时利用图案微阵列技术探索一种快速、对细胞损伤较小的单克隆细胞获得方式，并以延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，Fah）基因（简称：Fah基因）敲除为例，以期实现高效快速地获得Fah基因敲除细胞。本研究流程图如图 1 所示。
图1
高效获得猪基因编辑单克隆细胞实验流程图
Figure1.
Flow chart of experiments for efficient acquisition of pig gene-edited monoclonal cells
1 材料和方法
1.1 实验材料与试剂
实验中所使用的细胞株包括：家猪皮肤细胞（domestic pig skin cells，SSC-S1），小香猪皮肤细胞（small pig skin cells，SSC-S2），小耳猪肾细胞（small ear pig kidney cells，SEPfk），小耳猪肺细胞（small ear pig-lung cells 1，SEP-L1）以及猪肾上皮细胞（porcine kidney epithelial cells，PK15）来于中国科学院昆明动物所；猪髋动脉内皮细胞（porcine hip arteries endothelial cells，PIEC）来自于中科院上海细胞库；小型猪肾细胞（mini pig kidney epithelial cells，MPK），来自于中国食品药品检定研究院；猪睾丸细胞（porcine testicular cell，ST），猪肾传代细胞（porcine kidney cells-2，IBRS-2）来自于中国典型培养物保藏中心细胞库，总计 9 种细胞。sgRNA 骨架表达载体 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen，购自中国汉恒生物公司；Cas9 慢病毒购自中国汉恒生物公司。兔抗 Cas9 抗体购自美国 Abcam 公司；T4 多聚核苷酸激酶、快速连接试剂盒均购自美国 NEW ENGLAND BioLabs 公司；无内毒素小提中量试剂盒购自中国天根生化科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、DMEM 高糖培养基、RPMI 1640 培养基、MEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Gibco 公司；兔抗人、鼠 Fah 抗体购自中国 BIOSS 公司；用于细胞测序的 T 克隆载体 pClone007 试剂盒购自中国擎科生物公司。
1.2 构建猪 Cas9 稳定表达细胞株
用 MEM 培养基+10%FBS 培养 IBRS-2、ST 细胞；用 DMEM 高糖培养基+10 % FBS 培养 PK15、MPK、SSC-S2、SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞；用 RPMI 1640 培养基+10 % FBS 培养 PIEC 细胞。随后将生长状态良好的细胞制成细胞悬液，并以 1 × 105 个/孔的细胞密度接种到 24 孔板中。待目的细胞达到约 30%～50%融合密度时加入 Cas9 慢病毒。Cas9 慢病毒滴度为：108 TU/mL；PIEC、ST、IBRS-2、PK15 细胞的最适感染复数（multiplicity of infection，MOI）为：30；SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞的最适 MOI 值为：20。病毒感染细胞 72 h 后，在培养液中加入嘌呤霉素，进行抗性筛选并获得 Cas9 稳定表达细胞株。PIEC 细胞筛选浓度为 1 μg/mL，IBRS-2 细胞筛选浓度为 2.5 μg/mL；PK15 细胞筛选浓度为 2 μg/mL；ST 细胞筛选浓度为 2.5 μg/mL；SEPfk、SEP-L1、SSC-S1 细胞筛选浓度为 0.5 μg/mL。
1.3 Cas9 稳定表达细胞株免疫组织化学染色
将 2 × 105个细胞接种于底部放有玻片的 24 孔板中，进行细胞接种实验。细胞培养过夜后，用 PBS 清洗三遍，10% 福尔马林固定细胞 5 min，PBS 再次清洗三遍，取出细胞玻片，黏于载玻片干燥过夜，随后使用兔抗 Cas9 抗体对细胞玻片进行常规免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色。
1.4 Cas9 稳转猪细胞转录组测序以及蛋白质组定量分析
抽提 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 细胞以及相对应的 Cas9 稳转细胞的 RNA 样品，送到华大基因公司进行细胞表达谱信息采集。提取 PIEC- Cas9，PK15- Cas9，IBRS-2-Cas9，ST- Cas9 四种稳转细胞的蛋白送到上海易算生物公司进行蛋白质组学定量分析。将测序结果整理后，搭建常见猪基因组/蛋白表达情况查询网页，便于查询以及比较不同猪细胞的基因以及蛋白表达量。
1.5 构建 Fah基因的 sgRNA 表达载体
合成 3 条靶向Fah基因的 sgRNA，即Fah-sgRNA1、Fah-sgRNA2、Fah-sgRNA3，其正向和反向寡核苷酸序列分别如表 1 所示。将Fah-sgRNA 对应的正向和反向寡核苷酸序列进行磷酸化、退火、复性，形成具有粘性末端的双链 DNA 片段。利用 BamHI、EcoRI 限制性内切酶酶切目标载体 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen，随后电泳分离并胶回收 pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsCreen 线性载体。将复性得到的Fah-sgRNA 双链 DNA 片段与回收得到的线性载体片段进行连接反应，然后将连接混合物转化到大肠杆菌 DH5α 菌株。将连接正确的质粒扩增后，采用无内毒素小提中量试剂盒抽提质粒，用于细胞转染实验。
表1
Fah基因 sgRNA 序列
Table1.
The sgRNA sequence of Fah gene
1.6 Fah基因的 sgRNA 表达载体转染实验
本实验采用电转仪将质粒转入 PIEC-Cas9 靶细胞，方法如下：将生长状态良好的细胞经胰蛋白酶消化，并用电转液稀释成浓度为 1 × 106～2 × 106 个/mL 的细胞悬液。将上述提取的 1 μg sgRNA 表达质粒，与约 2 × 105 个细胞混合置于 96 孔板中，按照电压 200 V、脉宽 200 μs、间隔 1 000 ms 的条件进行电转实验，然后将电转后的细胞平均三等分转入 24 孔板中培养。
1.7 流式分析细胞感染效率以及分选阳性转染细胞
细胞转染 48 h 后先进行扩增培养，然后将贴壁细胞经胰酶消化，离心后用新鲜培养基重悬，将细胞悬液移至无菌的流式检测管，检测质粒转染效率并分选荧光表达阳性的细胞到 24 孔板中，进一步扩增阳性细胞。
1.8 错配酶切法检测Fah基因敲除效果
收集部分目的细胞，抽提基因组 DNA，同时抽提野生型目的细胞的基因组 DNA。以基因组 DNA 为模板分别用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增靶基因Fah序列片段。扩增靶基因片段的引物如表 2 所示。电泳检测 PCR 产物并回收纯化，将纯化后的 DNA 片段分别加热变性、复性，形成杂交 DNA 分子。用 T7 核酸内切酶 I（T7 endonuclease I，T7EI）切割复性后的杂交 DNA，检测 sgRNA 介导的 Fah基因敲除效果。
表2
Fah基因靶点扩增引物序列
Table2.
Primer sequences for Fah target gene amplification
1.9 利用图案微阵列法快速获得Fah基因敲除单克隆细胞以及鉴定
使用激光蚀刻的特定图案硅片为模板，倒模获得聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）印章，制备出具有特定微图案的 PDMS 印章（面积为 225 μm2的矩形）。将浓度为 100 μg/mL 的纤连蛋白涂布于印章表面，室温孵育 20 min 后洗去多余的溶液。在 37 ºC 孵箱中干燥，然后将图案印压于细胞非黏附培养皿底部，待图案形成后移去印章。图案干燥后，加入 1% 嵌段式聚醚 F-127 室温孵育 2 h，封闭剩余培养皿底部上的空间。具体制备方法如图 2 所示。随后将经过流式分选的 1 × 103 个细胞种植到微阵列培养皿中连续监测细胞生长，并挑取单克隆细胞球。
图2
图案微阵列印章法获得单克隆细胞流程
Figure2.
The process of obtaining monoclonal by microarray seal
1.10 T 载体测序鉴定单克隆细胞Fah基因敲除情况
收集待检测的单克隆细胞，抽提基因组。PCR 扩增单克隆细胞的Fah基因片段，使用胶回收试剂盒切胶回收Fah目的片段，利用 pClone007 试剂盒将Fah PCR 产物连接到 T 载体。为了分析每个单细胞克隆的正义链以及反义链的突变情况，对每个单克隆细胞进行 6 个 T 载体的克隆测序，以确保单克隆的纯度。
1.11 Fah基因敲除细胞免疫荧光染色以及 IHC 染色
在 24 孔板底部放入玻片，将 2 × 105个细胞接种于 24 孔板，细胞培养过夜。使用 10% 福尔马林固定细胞 5 min，用 PBS 清洗三遍，随后取出细胞玻片，黏于载玻片上干燥过夜。使用兔抗人、鼠 Fah 抗体进行常规 IHC 以及免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色。
2 结果
2.1 利用慢病毒载体构建猪 Cas9 稳定表达细胞株
在本研究中，SSC-S2、SEPfk、SSC-S1、SEP-L1、MPK 这五种细胞，本身增殖就相对较缓慢，在经过慢病毒转染以及加入嘌呤霉素筛选两个连续过程后，细胞增殖则更加缓慢，细胞状态较差，死亡较多，无法构建成 Cas9 稳定表达细胞株，不适合作为工具细胞长时间使用。经过慢病毒转染以及嘌呤霉素抗性筛选两个过程，PIEC、PK15、ST、IBRS-2 这四种猪细胞仍保持良好的细胞形态以及增殖能力。与转染了 Cas9 慢病毒的细胞相比较，未转染 Cas9 慢病毒的对照组细胞在加入嘌呤霉素 72 h 以后几乎全部死亡，意味着筛选效率达 100%。在经过连续 7 d 的嘌呤霉素筛选后，四种 Cas9 稳转细胞生长状态良好，与正常细胞相比无明显差异，如图 3 所示。因此，最终经过对常见猪细胞株的筛选实验，获得了 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、ST-Cas9、IBRS-2-Cas9 四种猪 Cas9 稳转细胞。为进一步证实稳转细胞的 Cas9 表达情况，利用 IHC 对稳转细胞进行验证，直观可见四种细胞均高效表达 Cas9 核酸酶蛋白，如图 3 所示。
图3
猪 Cas9 稳定表达细胞株的构建
Figure3.
Construction of stable Cas9-expressing cell lines of pigs
2.2 转录组测序分析猪 Cas9 稳定表达细胞株
本研究对 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 四株细胞系以及对应的 Cas9 稳转细胞即 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 进行转录组测序，并且进行比较分析。为了反映样本间基因表达的相关性，本研究计算了每两个样品之间所有基因表达量的皮尔森（Pearson）相关系数，并将这些系数以热图的形式反映出来，如图 4 所示。从样品间相关性分析结果可以看出 PIEC 与 PIEC-Cas9、PK15 与 PK15-Cas9、IBRS-2 与 IBRS-2-Cas9、ST 与 ST-Cas9，呈现相关性最高，Pearson 相关系数均在 0.9 以上，而 PIEC、PK15、IBRS-2、ST 四种细胞之间基因表达相关性则相对较低。
图4
细胞基因以及蛋白表达分析
Figure4.
Analysis of cell gene and protein expression
转录组基因表达量以每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数（fragments per kilobase per millions base pairs sequenced，FPKM）值来衡量。对 FPKM（FPKM ≤ 1、FPKM 1～10、FPKM ≥ 10）的三种情况进行基因数目的统计，结果表明不同细胞存在不同基因的表达量区别，说明利用细胞筛选靶向猪基因组的 sgRNA 要根据基因表达情况，选定不同的猪细胞进行实验，更有益于筛选并验证出靶基因的 sgRNA 打靶效果。同时，由于慢病毒是随机整合到细胞基因组，因此会无法避免地造成原有细胞基因组的微小改变，而引入 Cas9 核酸酶蛋白基因后，细胞基因表达量虽有所改变，但与对应的野生型细胞（wide type，WT）相比较仍然显示出很强的相关性。
2.3 猪 Cas9 稳定表达细胞株蛋白质组定量分析
对猪 PIEC-Cas9、PK15-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 稳转细胞进行蛋白质组定量分析，本研究获得了每种稳转细胞的蛋白组表达情况。如图 4 所示，由截选的部分蛋白表达热图可见四种 Cas9 稳转细胞的蛋白表达差异。为方便流程化检索，搭建了常见猪细胞系基因以及蛋白表达检索平台 PiGenEditer（网址为：https://www.omicsolution.org/wukong/PiGenEditer/）。通过输入基因或蛋白号即可查询并比较不同细胞的基因或者蛋白表达量。利用该平台快速查出目的细胞基因或蛋白表达水平，综合二者表达情况，以快速确定靶基因表达较高的 Cas9 稳转猪细胞，进行 sgRNA 体外筛选实验。经综合评估 mRNA 以及蛋白表达情况，本实验用于构建Fah基因敲除的细胞选定为 PIEC-Cas9。
2.4 靶向Fah基因 sgRNA 设计以及筛选
对Fah基因前 5 个外显子编码区序列进行 sgRNA 设计，根据 sgRNA 设计软件所示综合评分，选择 3 条Fah-sgRNA，即Fah-sgRNA-2、Fah-sgRNA-3、Fah-sgRNA-4，分别打靶 2 号（#2）、3 号（#3）、4 号（#4）外显子。将选择的 sgRNA 序列连接到表达载体后，利用电转仪将Fah-sgRNA 表达质粒快速转入 PIEC-Cas9 细胞，转染 24 h 后使用显微镜观察细胞，细胞生长状况良好，无明显死亡。在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）高效表达，指示了 sgRNA 在细胞内的高效表达，如图 5 所示。
图5
sgRNA 筛选以及富集基因编辑细胞
Figure5.
sgRNA screening and enrichment of gene-edited cells
为筛选出有效的 sgRNA，在电转 72 h 后收集细胞，提取细胞基因组 DNA，利用 PCR 扩增靶序列，随后进行 T7EI 错配酶切实验。如图 5 所示，靶向Fah基因 2 号、4 号外显子的 sgRNA 为 T7EI 错配酶切阳性结果，表明 sgRNA 对靶序列基因片段进行了有效切割，并引入了突变。结合 T7EI 错配酶切结果以及 sgRNA 选择原则，即选用比较靠前的外显子为靶序列，因此本实验选择靶向Fah基因 2 号外显子的 sgRNA 即Fah-sgRNA-2，用于构建Fah基因敲除细胞。随后将电转了Fah-sgRNA-2 质粒的细胞利用流式进行检测，结果显示表达 GFP 的阳性细胞占 47.4%，同时本文通过无菌分选富集这部分阳性细胞，用于后续单克隆挑选。
2.5 利用微阵列培养技术快速获得基因敲除单克隆细胞
为了克服单克隆细胞获得率低、状态差、生长周期长的问题，本研究通过图案微阵列培养技术，可以快速收获由单个细胞增殖而来的细胞球。如图 6 所示为荧光蛋白标记的微阵列印章形状，细胞将在每个荧光小方格所示的位置上生长。
图6
微阵列孔板培养细胞获得Fah基因敲除细胞
Figure6.
Fah gene knockout cells were obtained from microarray plate
如图 6 所示，将细胞按一定密度种植于微阵列孔板中，通过对细胞进行连续 4 d 的监测，在固定位置上清晰可见单个细胞以及分裂增殖了的细胞贴壁生长。在 24～48 h 内，细胞开始由贴壁状态转为呈三维球状生长，逐渐形成约 50 μm 的细胞球。在 96 h 以后细胞球几乎不再继续增长，保持在约 100 μm，同时可见个别细胞球开始松动，欲脱离原有位置。第 5 d 开始细胞球经过摇晃或使用移液枪轻轻吹打，可以自动成球脱落。将脱落的细胞球进行稀释，肉眼即可看见悬浮的细胞球。将单个细胞球吸出吹散后，进行扩增培养，48 h 即可快速获得生长状态良好的细胞。本实验随机吸取两个细胞球，进行 T 载体测序分析，分别获得了一个纯和突变以及一个杂合突变的基因编辑细胞。对纯和突变的细胞进行 IHC 以及 IF 验证，通过与 WT 细胞相比较，经过基因敲除的细胞（knockout，KO）不表达 Fah 蛋白，表明成功获得Fah基因突变细胞。
3 讨论
CRISPR/Cas9 系统发挥作用主要依赖于高效的特异性 sgRNA 以及通用的 Cas9 核酸酶蛋白[15]。目前，CRISPR/Cas9 系统导入细胞最常见的方式主要包括两种。一种是病毒介导的，即通过慢病毒、腺病毒或者腺相关病毒载体携带 CRISPR/Cas9 系统转染到细胞中。另外一种是非病毒方式介导的，如通过脂质体等转染试剂将 CRISPR/Cas9 系统表达质粒转入到细胞中[16-18]。但以上方式都因为 Cas9 核酸酶蛋白基因片段较大，很难将 Cas9 核酸酶蛋白以及荧光蛋白或者其他抗性筛选基因同时包装到一个载体中，以至于无法评估转染效率[19-21]。另外还有一种方式是将 Cas9 核酸酶蛋白以及 sgRNA 在体外转录后形成复合物，再通过转染试剂或电转仪将其转染到细胞。然而由于蛋白分子较大，因此转染效率也非常的低[22-23]。针对一些悬浮细胞，转染难度则更大，转染效率更低。CRISPR/Cas9 系统转染效率直接影响了获得基因编辑细胞的效率，而以上提到的转染大片段质粒或者蛋白都会大大降低转染效率。基于以上原因，先构建 Cas9 稳转细胞，再转入 sgRNA 则可以大大提高 CRISPR/Cas9 系统转染效率，进而提高获得基因编辑细胞的效率。本实验利用慢病毒成功构建了四种猪 Cas9 稳转细胞，这些稳转细胞可以作为筛选靶向猪基因组的 sgRNA 工具细胞，在后续实验中仅需在细胞里引入带 GFP 的 sgRNA 质粒即可实现基因编辑，并观察转染效率。
利用 CRISPR/Cas9 技术进行高效率的基因编辑，其中一个关键在于 sgRNA 的筛选[24]。尤其对于繁育周期较长的大动物，为节约时间和资金成本，必须在体外验证出高效的 sgRNA，因此需要选定一株合适的细胞进行 sgRNA 效率筛选实验。然而由于不同的细胞在 mRNA 水平以及蛋白水平表达存在差异，因此本实验对构建的 PK15-Cas9、PIEC-Cas9、IBRS-2-Cas9、ST-Cas9 稳转细胞进行 mRNA 以及蛋白水平的测定，并且搭建了常见猪细胞 mRNA/蛋白水平表达查询网页，可以快速选择一株适合的细胞，在基因以及蛋白水平对 sgRNA 敲除效果进行筛选以及验证。
另外，富集成功转染 CRISPR/Cas9 系统的目的细胞，以期获得基因编辑的活细胞也十分重要[25-28]。因此本文研究探索了一种利用 Cas9 稳转猪细胞结合荧光报告的质粒载体来富集含有基因突变细胞的有效方法，即以 Cas9 稳定表达细胞作为工具细胞，将带有 GFP 筛选标签的靶基因 sgRNA 导入细胞，快速实现了基因编辑。另外为了高效地将 sgRNA 转入细胞，同时避免较高成本的病毒包装，采用电转染的方式将包含 GFP 的 sgRNA 表达质粒转入 Cas9 稳转细胞，建立了高效的 Cas9 稳转细胞电转染方案，以此增加转染效率，进一步增强基因编辑效率，筛选出高效的 sgRNA。
人类肝细胞的短缺是肝细胞移植治疗代谢性肝病的一个重要障碍[29-30]，因此本研究期望Fah缺陷猪可以成为人肝细胞的体内孵育器，从而为治疗人类代谢性肝病以及肝细胞移植提供个体化的方法，因而选定Fah为靶基因。本研究利用 PIEC-Cas9 细胞，经过电转的方式将带有 GFP 指示的 sgRNA 高效转入细胞，筛选得到有效靶向Fah基因的 sgRNA，随后利用流式细胞术对 GFP 强表达的细胞进行无菌分选，以此富集阳性细胞。
另外，为了提升单克隆细胞的获得效率，本研究使用图案微阵列技术，在细胞培养皿底部限制细胞生长以及黏附空间，使得细胞在培养 24 h 后形成三维细胞树样结构，进而在培养 96 h 后形成直径在 100 μm 左右的三维细胞微球。由于该微球与培养底面接触面狭小，黏附不牢固，所以当细胞球长成一定大小以后，摇动或者用移液枪轻轻吹打，其会自动从底面脱落。脱落的细胞球肉眼可见，将这些脱落的细胞球稀释，吸取单个细胞球分别于孔板中吹散后培养，仅需一周即可快速获得生长状态良好的单克隆细胞。基于以上策略，本研究快速获得了两个Fah基因敲除单克隆，大大缩短了单克隆细胞的获得时间。
综上所述，本文方法能够高效富集靶向猪基因组修饰的细胞，并且创新性地利用图案微阵列技术获得单克隆，大大加速单克隆的获取效率，为大批量挑取单克隆提供了有效方法，同时，获得的Fah基因突变细胞也为生产基因编辑猪以及基础医学研究等后续工作奠定了基础。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
